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細胞循環(huán)機械拉伸系統(tǒng)在肺上皮細胞的應用

更新時間:2023-02-17 點擊量:1235

一、背景

呼吸機引起的肺損傷 (VILI) 是急性肺損傷 (ALI) 或急性呼吸窘迫綜合征 (ARDS) 患者最常見的并發(fā)癥之一。雖然p120是調(diào)節(jié)細胞連接的重要蛋白質(zhì),但應探索預防和治療VILI的進一步機制。

二、方法

用p12小干擾(si)RNA,p120 cDNA,野生型E-鈣粘蛋白并列膜結(jié)構(gòu)域或K120R突變并列膜結(jié)構(gòu)域(K83R-JMD)轉(zhuǎn)染的小鼠肺上皮細胞(MLE-83)進行20%循環(huán)拉伸2或4小時。此外,用c-Src抑制劑PP預處理的MLE-12細胞和小鼠2或RhoA抑制劑Y27632,分別經(jīng)歷20%的循環(huán)拉伸或機械拉伸。此外,野生型C57BL / 6小鼠在機械通氣前轉(zhuǎn)染p120 siRNA-脂質(zhì)體復合物。然后分析細胞裂解物和肺組織以檢測肺損傷。

三、結(jié)果

20%活性c-Src的循環(huán)拉伸,誘導E-鈣粘蛋白,p120和封閉素的降解。然而,p120的缺失增加了E-鈣粘蛋白的降解和內(nèi)吞作用。免疫沉淀和免疫熒光結(jié)果顯示p120和E-鈣粘蛋白之間的關(guān)聯(lián)降低,而p120 siRNA和K83R-JMD組在20%循環(huán)拉伸后間隙形成增加。p120的缺失還降低了閉塞素水平,并通過增強RhoA活性降低了閉塞素和ZO-1的關(guān)聯(lián)。然而,封閉素和E-鈣粘蛋白水平的改變被PP逆轉(zhuǎn)2或Y27632處理與循環(huán)拉伸組相比。一致地,p120過表達組在20%循環(huán)拉伸后,連接蛋白的表達、再分布和解離均恢復。此外,p120在機械通氣下通過增加濕/干稱重比和增加p120耗盡小鼠細胞因子(腫瘤壞死因子-α和白細胞介素-六)的產(chǎn)生來證實p<>在VILI中的作用。

細胞機械循環(huán)拉伸

圖1

環(huán)狀拉伸對粘附連接蛋白和緊密連接蛋白的影響。將柔性細胞板上的MLE-12細胞單層經(jīng)受20%循環(huán)拉伸2或4小時。 (a)蛋白質(zhì)印跡顯示p120,E-鈣粘蛋白和封閉素在循環(huán)拉伸后減少。(b) 提取膜和細胞質(zhì)蛋白。通過蛋白質(zhì)印跡測定E-鈣粘蛋白在膜和細胞質(zhì)中的表達。周期性拉伸可誘導E-鈣粘蛋白內(nèi)吞作用。(c)免疫熒光染色和定量數(shù)據(jù)顯示p120和E-鈣粘蛋白在循環(huán)拉伸下結(jié)合。固定MLE-12細胞并用抗p120和抗E-鈣粘蛋白染色,然后用Alexa偶聯(lián)的二抗染色。(d)肌動蛋白細胞骨架重塑是通過用德克薩斯紅偶聯(lián)鬼筆環(huán)肽(紅色)進行免疫熒光染色來確定的。由循環(huán)拉伸引起的細胞間隙用箭頭標記。細胞核(藍色)用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色。比例尺 = 10 μm。*p < 0.05 與對照組相比,+p < 0.05 與 CS 2 h 組相比。實驗至少重復三次

四、結(jié)論

p120通過調(diào)節(jié)粘附和緊密連接來防止VILI。p120通過增加p120與E-鈣粘蛋白的并列膜結(jié)構(gòu)域之間的關(guān)聯(lián)來抑制E-鈣粘蛋白內(nèi)吞作用。此外,p120通過抑制RhoA活性來減少閉塞素的降解。這些發(fā)現(xiàn)說明了p120預防VILI的進一步機制,特別是對于ALI或ARDS患者。

CELL TANK

國產(chǎn)細胞牽張拉伸應力培養(yǎng)系統(tǒng)

HOW TO USE

1. 細胞外基質(zhì)涂層進行預處理,將細胞接種到腔室中,細胞粘附在基底上,開始過夜培養(yǎng)過程。

2. 細胞增殖后,選擇拉伸模式并開始循環(huán)刺激。

3. 根據(jù)實驗目標收獲/處理細胞,分析數(shù)據(jù)。

橫桿拉伸技術(shù)局部應變率更均勻

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